Gambar 1. Contoh produk amplifikasi 545 bp adegan gen H5 yang diperoleh TPR dengan denai antigenik. Lane A, B, C, D, dengan E merupakan isolat mikrob flu burung, lane (-) merupakan kontrol buruk dengan lane L merupakan DNA ladder 100 bp

102

Tapak Perlekatan Reseptor Virus Flu Burung

yang Diisolasi dari Berbagai Unggas

Sejak tahun 2003 cukup 2008

(RECEPTOR BINDING SITE OF AVIAN INFLUENZA VIRUS H5N1

ISOLATED FROM VARIOUS POULTRIES SINCE 2003 TO 2008)

Michael Haryadi Wibowo 1), Charles Rangga Tabbu 2),

Widya Asmara 1), Heru Susetya 3)

Bagian Mikrobiologi 1), Bagian Patologi 2), Bagian Kesehatan Masyarakat Veteriner 3), Fakultas

Kedokteran Hewan, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Jl. Fauna 2, Karangmalang,

Yogyakarta 55281. Email: bowomikro@yahoo.com

ABSTRAK

Penyakit flu burung/ avian influenza merupakan kebobrokan infeksius atas ayam yang disebabkan oleh

virus pilek corak A yang teperlus di keluarga Orthomyxoviridae. Virus tersebut mempunyai rentang

inang yang luas, ialah beragam spesies burung, mamalia dengan manusia. Dewasa ini kaum peneliti

melaporkan terjadinya kenaikan jangkitan mikrob flu burung subtipe H5N1 atas mamalia dengan manusia.

Kondisi tersebut telah menimbulkan ancar-ancar bahwa mikrob flu burung yang bersirkulasi di lapangan mungkin

mengalami mutasi masam amino yang bertanggung balasan di pembelengguan reseptor yang disebut sebagai

tapak perlekatan reseptor (TPR). Penelitian ini dirancang untuk melancarkan karakterisasi molekuler

pada adegan gen HA yang diperoleh TPR atas mikrob flu burung subtipe H5N1 yang diisolasi dari berbagai

spesies sejak tahun 2003 cukup 2008. Amplifikasi adegan gen HA dilakukan dengan reverse transcriptase

polymerase chain reaction (RT-PCR). Semua produk RT-PCR positif selanjutnya disekuensing untuk

mengetahui susunan nukleotida adegan gen target. Hasil sekuensing tersebut akan datang dianalisis dengan

program Mega 4.0, yang meliputi: multiple alignment, deductive amino acid prediction, dan phylogenetic

tree. Hasil investigasi membuktikan kaum masam amino TPR yang bersifat abadi dengan diindikasikan

cenderung untuk bertalian dengan reseptor corak unggas, ialah masam sialat α 2, 3 galaktosa. Satu isolat

virus flu burung yang diteliti, ialah A/ layer/Jabar/MHW-RBS-02/2008 cecap delesi masam amino

posisi 129 dengan mutasi masam amino kedudukan 151 isoleusin jadi treonin. Analisis tanaman kekerabatan

menunjukkan pengelompokan mikrob flu burung tersebut tak membuktikan cermin distribusi tertentu dari

spesies ungas mau juga ceceran geografis akar mikrob yang diteliti.

Kata-kata kunci : flu burung, haemagglutinin, masam amino, denai perlekatan reseptor.

ABSTRACT

Avian Influenza (AI) is an infectious disease in poultry, caused by type A of avian pilek virus

(AIV), in the family of Orthomyxoviridae. Almost all birds’ species are sensitive to the AI. Beside the

ability to infect various species of poultry. AIV type A has a wide range of host including all bird species,

mammals, dengan human. Today some scientists reported that the cases of AI in mammals, including humans

are increasing. This condition suggests that the AI mikrob circulated in the field may have some mutations

in the amino acid determinants responsible receptor binding site (RBS). A research was therefore designed

to investigate the molecular kelas of HA gen fragment responsible for receptor binding site of AIV isolated

from various poultry since 2003 to 2008. Molecular characterization was based on the amplification of

receptor binding site of HA gene by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). All RT-

PCR of HA gene positive products were sequenced to determine the nucleotide composition at the targeted

fragment. Sequences yielded were analyzed by acara Mega 4.0 versions, including multiple alignment,

deductive amino acid prediction, and establishment of phylogenetic tree. The results show that all AIV

isolates could be determined of some conserved amino acids residues responsible for RBS which indicate

the binding preference of avian like receptor, sialic acid α 2, 3 galactose except isolate A/Layer/Jabar/

MHW-RBS-02/2008 which could be found a deletion of amino acid at position of 129 dengan mutation of 151

isoleucine into threonine. Phylogenetic study showed that clustering of AIV did not base on species of bird

or geographic origin of AI viruses which were studied.

Key words: avian influenza, haemagglutinin, amino acid, receptor binding site

Jurnal Veteriner Juni 2012 Vol. 13 No. 2: 102-112

ISSN : 1411 - 8327

103

PENDAHULUAN

Penyakit flu burung/ avian influenza (AI)

di Indonesia, atas awalnya kedapatan sebagai

penyebab kematian ayam yang layak tinggi

di sebanyak peternakan unggas petelur komersial

di Jawa Barat dengan Jawa Tengah, sejak tahun

2003. Penyebaran kebobrokan tersebut terus

meluas ke beragam propinsi lain, dengan pada

tahun 2007 hampir sarwa propinsi dilaporkan

endemis kebobrokan AI atas unggas, kecuali

Propinsi Maluku dengan Gorontalo (Komnas FBPI,

2007). Dewasa ini perkembangan jangkitan virus

flu burung H5N1 dinilai mulai mengkuatirkan,

karena becus melewati sawar/ barrier

pertahanan antar spesies. Beberapa laporan

yang mendukung data tersebut di atas, antara

lain afair kebobrokan AI subtipe H5N1 atas dua

harimau (Panthera tigris) dengan duet leopards

(Panthera pdanus) atas sebuah kebun binatang

di Thailand (Kheawacharoen et al., 2004), pada

kucing dengan anjing (Songserm et al., 2006-a dan

Songserm et al., 2006-b ), atas babi (Takano et

al., 2009), dengan atas bani Adam yang mula-mula kali

dilaporkan atas bulan Mei 1997 di Hongkong

(Subbarrao et al., 1998).

Kemampuan mikrob flu burung untuk dapat

menginfeksi pembantu ditentukan oleh hemaglutinin

(H/HA), ialah spike glikoprotein terluar yang

berbentuk suatu homotrimer dengan dikode oleh

segmen gen ke-4 dengan panjang 1778 nt. (Cox

dan Kawaoka, 1998). Monomer H/HA terdiri

dari bagian kaput yang berupa globulus yang

dihubungkan dengan fibrous stalk domain dan

terdiri dari duet irisan polipeptida, ialah H1

dan H2. Kedua irisan tersebut terbentuk

dengan cara jalan lepas (cleavage) oleh enzim

inang di alun-alun cleavage site (CS) (Horimoto dan

Kawaoka, 1997; Horimoto dengan Kawaoka, 2001;

Horimoto dengan Kawaoka, 2005).

Segmen H1 juga mengdanung semua

pendana fiil antigenik yang bersifat protektif

dan receptor binding cavity (RBC). Segmen

tersebut sebagai kampil yang terletak pada

ujung distal HA1 yang membentuk tempat

untuk melilit masam sialat dengan menjadi

perantara untuk perlekatan HA dengan

permukaan sel inang, (Roger et al., 1983, sitasi

oleh Naeve et al., 1984). Dalam RBC tersebut

terdapat masam amino yang bertanggung jawab

pada receptor binding site (RBS) alias tapak

perlekatan reseptor (TPR) (Cox dengan Kawaoka,

1998; Kovacova et al., 2002). Asam amino pada

TPR berperan bena untuk bertalian dengan

asam sialat atas ujung terminal oligosakharida,

antara beda α 2,6 sialyl lactosa, N-

acetylneuraminic acid α 2,6 Galactosa dengan α

2,3 sialyllactosa, Neuraminic acid α 2,3

Galactosa (Suzuki et al., 2000). Pada umumnya

semua struktur HA mikrob flu burung

mempunyai konfigurasi RBC yang mirip, terdiri

dari tiga elemen struktural, ialah α-heliks ( 190-

heliks, HA1 : 188 cukup 190), dengan duet loops,

yaitu 130-loops ( HA1:134 cukup 138) serta

220-loops (HA1: 221 cukup 228). Pemberian

nomor tersebut berdasarkan sistem penomeran

virus influenza subtipe H3. Menurut Zhou et

al., (2007) kaum masam amino bena yang

bertanggung balasan atas TPR dengan bersifat

lestari atas mikrob flu burung subtipe H5N1,

yaitu atas kedudukan Y 91, W 149, I 151, H 179, N

182, E 186, 190 L dengan 192 Q (H5 numbering

system). Residu masam amino atas RBC tersebut

merupakan conserved residu yang penting

dalam spesifitas pembelengguan reseptor atas virus

flu burung subtipe H1 dengan H5 (Kovacova et al.,

2002; Steven et al., 2006; Zhou et al, 2007),

disamping masam amino tersebut, ampas posisi

191 (Kovacova et al.,2002), kedudukan 132 (Muramoto

et al., 2006), dengan kedudukan 129 (Smith et al., 2006)

juga merupakan masam amino bena atas TPR.

Asam amino tersebut atas umumnya bersifat

lestari di spesifitas pembelengguan reseptor

virus influenza subtipe H1 dengan H5 (Kovacova et

al., 2002; Steven et al., 2006; Zhou et al. 2007).

Proses jangkitan mikrob flu burung, tidak

semata-mata ditentukan oleh patogenisitas

virus flu burung saja, melainkan juga oleh

kemampuan mikrob tersebut untuk berikatan

dengan reseptor inang. Untuk itu diperlukan

kesesuaian TPR yang sedia atas mikrob flu burung

dengan reseptor atas latar sel inang.

Sejauh ini kedapatan bahwa masam sialat (SA) α

2,3 galaktosa merupakan reseptor untuk virus

influenza akar ayam dengan hewan, sedangkan

reseptor α 2,6 galaktosa merupakan reseptor

untuk mikrob influenza akar manusia. Naeve et

al., (1984) dengan Gambaryan et al., (2006)

melaporkan bahwa kemampuan mikrob influenza

dalam menembus barikade penjagaan spesies,

diduga erat berhubungan dengan pergeseran

preferensi mikrob tersebut untuk berikatan

dengan reseptor SA α 2,3 galaktosa ke AS α 2, 6

galaktosa alias sebaliknya.

Kasus kebobrokan flu burung atas unggas

masih berlaku menurut kadang-kala di beberapa

wilayah di Indonesia. Dewasa ini telah

dilaporkan banyak afair kebobrokan flu burung

yang berlaku atas mamalia teperlus manusia.

Kondisi tersebut menimbulkan ancar-ancar bahwa

Wibowo et al Jurnal Veteriner

104

peningkatan afair jangkitan mikrob flu burung pada

mamalia dengan bani Adam tersebut mungkin

berhubungan dengan metamorfosis lingkungan penting

pada TPR mikrob flu burung akar unggas. Untuk

menjawab persoalan tersebut diperlukan

penelitian atas tingkat molekuler khususnya

pada adegan gen HA yang diperoleh TPR, pada

virus flu burung subtipe H5N1 akar berbagai

unggas yang diisolasi sejak tahun 2003 sampai

2008.

METODE PENELITIAN

Virus yang diteliti

Materi elementer investigasi ini berupa isolat

virus flu burung akar kaum spesies unggas

yang dikoleksi sejak tahun 2003 cukup 2008

dari Jawa Tengah, Daerah Istimewa

Yogyakarta, Jawa Barat, Jawa Timur, dan

Lampung. Isolat tersebut telah diidentifikasi

secara serologis dengan molekuler sebagai mikrob flu

burung subtipe H5N1 oleh penulis. Isolasi,

propagasi, dengan teknik molekuler dikerjakan di

Laboratorium Mikrobiologi, Fakultas

Kedokteran Hewan, UGM dengan fasilitas

biosafety cabinet kelas III. Sekuensing dilakukan

di Laboratorium Biotechnology, (PT. Charoen

Pockphan Indonesia, Jakarta).

Perbanyakan Virus.

Propagasi isolat mikrob flu burung dilakukan

secara in ovo menggunakan telur ayam

berembrio spesific pathogen free (SPF) umur 11

hari. Adanya pertumbuhan mikrob flu burung

ditentukan dengan tes hemaglutinasi (HA) dan

dilanjutkan dengan tes batu ganjalan hemaglutinasi

(hemagglutination imhibition/HI) mengguna-

kan anti serum distingtif mikrob flu burung subtipe

H5N1. Hasil propagasi menurut in ovo tersebut

kemudian diperiksa menurut molekuler. Prosedur

isolasi dengan pengenalan tersebut membentuk pada

manual on animal pilek diagnosis dan

surveillance (WHO, 2002).

Isolasi RNA

Isolasi RNA mikrob AI dilakukan dengan

micro-to Midi RNA isolation kit (Invitrogen,

USA) bertemu dengan garis haluan stdanar yang

disarankan oleh Invitrogen. Pada prinsipnya,

sejumlah 0,2 ml isolat mikrob flu burung dalam

cairan korioalantois ditambahkan ke di 0,2

ml larutan pelisis yang mengdanung 0,002 ml

â-mercaptoethanol. Campuran tersebut,

kemudian disentrifugasi atas 12.000 x g selama

2 menit master 25ºC (refrigerated microcen-

trifuge, acuan 5804R, Eppendorf, Hamburg,

Germany). Supernatan dipindahkan ke dalam

tabung bersih dengan ditambah dengan 0,2 ml

etanol absolut. Sampel akan datang dimasukkan

kedalam RNA spin cartridge, dengan disentrifugasi

pada 12.000 x g selama 15 menit 25ºC. Cartridge

dicuci 1 x dengan 0,7 ml wash buffer I dengan 1 x

dengan 0,5 wash buffer II. Cartridge tersebut

kemudian dipindahkan ke di RNA recovery

tube. Sejumlah RNA diperoleh dengan

melakukan elusi cartridge tersebut dengan 0,03

ml RNAse-free water dengan cara disentrifugasi

pada kecepatan 12.000 x g selama 2 menit 25ºC.

Suspensi RNA yang diperoleh, akan datang dipakai

untuk template pada anggapan reverse

transcriptase-polymerase chain reaction (RT-

PCR).

Amplifikasi Gen HA yang Terdapat TPR.

Amplifikasi adegan gen HA yang terdapat

TPR dengan primer Lee et al., (2001) RBS

Forward: -5’ aca cat gcy car gac ata ct-3’- dan

Reverse: -5’cty tgr tty agt gtt gat gt 3’- dengan

target amplifikasi kedudukan 155 cukup 699, dan

produk produk amplifikasi sekitar 545 bp. Reaksi

dilakukan dengan kit Superscript III-one-step-

RT-PCR with platina Taq (Invitrogen)

menggunakan Gene-Amp PCR System 2400

(Applied Biosystem, USA). Master mix

Tabel 1. Daftar isolat mikrob flu burung yang

digunakan di penelitian

No Nama Isolat Virus Flu Burung

1 A/NC/Jogja/MHW-RBS-01/2008

2 A/Layer/Jabar/MHW-RBS-02/2008

3 A/Broiler/SMG/MHW-RBS-05/2008

4 A/NC/Jogja/MHW-RBS-06/2008

5 A/Quail/Solo/MHW-RBS-11/2007

6 A/MD/MTL/Pokja-RBS-15/2007

7 A/Layer/Solo/MHW-RBS-23/2007

8 A/Layer/Solo/MHW-RBS-25/2007

9 A/Quail/Solo/MHW-RBS-26/2007

10 A/MD/MTL/Pokja-RBS-16/2007

11 A/Quail/Jogja/MHW-RBS-30/2007

12 A/Layer/Jatim/MHW-RBS-AL1/2007

13 A/MD/Jogja-PST/RBS-UA1/2006

14 A/MD/MGL/UGM-RBS-UA2/2006

15 A/Duck/Jogja-PST/UGM/RBS-UA3/2006

16 A/Duck/Jatim/UGM/RBS-UA4/2005

17 A/Layer/MGL/MHW-RBS-AL2/2005

18 A/Layer/Jogja-KP/MHW-RBS-AL3/2004

19 A/Layer/Jogja/MHW-RBS-/2004

20 A/Duck/Jatim/MHW-RBS-8/2003

21 A/Layer/Purwokerto/MHW-RBS-12/2003

Jurnal Veteriner Juni 2012 Vol. 13 No. 2: 102-112

105

amplifikasi merupakan sebagai berikut: 2x reaction

mix 25 μl, primer forward 2 μl, primer reverse

1 μl (konsentrasi primer 40 pM/μl), Superscript

III/RT-Platinum Taq Mix 2 μl, RNA-se free

water 10 ìl dengan template RNA 10 μl, sehingga

total bagian anggapan merupakan 50 μl. Siklus

amplifikasi tersebut adalah: RT reaction 500 C

selama 30 menit, Initial hot start 940C selama

3 menit, denaturasi 940 C selama 30 detik,

annealing 43,50C selama 1 menit, extension 680

C selama 90 detik dengan final extension 680 C

selama 4 menit. Reaksi tersebut dilakukan

sebanyak 40 siklus.

Produk PCR divisualisasi dengan metode

elektroforesis menggunakan gel agarose 2% dan

pewarnaan dengan ethidium bromide (0,5 μg/

ml). Pita DNA yang teramplifikasi diamati di

dalam ruangan gelap menggunakan UV

transluminator, untuk selanjutnya didokumen-

tasi.

Sekuensing dengan Analisis Hasil Sekuens

Secara prinsip sekuensing dilakukan

sebagai berikut: komoditas PCR dimurnikan

terlebih dahulu dengan menggunakan kit

purifikasi Exo SAP-IT (USB Corporation)

sebelum di buat sekuensing, bertemu metode

yang direkomendasikan oleh produsen. Master

mix terdiri atas: Big Dye Terminator Cycler

Sequencing kit 8 μL, primer μL (10 μM), dan

DNA template disesuaikan dengan panjang yang

mencapai 20 ng/kb, dengan bagian akhir mencapai

20 μl. Siklus sekuensing dilakukan dengan

mesin PCR yang meliputi pre-denaturasi pada

suhu 960C selama 5 menit, dengan peredaran PCR

selama 25 kali dengan program: denaturasi pada

suhu 960 C selama 30 detik, annealing 43,50 C

selama 30 detik, dengan perluasan atas master 600 C

selama 1 menit. Hasil peredaran sekuensing

selanjutnya dimurnikan dengan Big Dye

XTerminator Purification kit, bertemu protokol

produsen. Produk yang telah murni tersebut

selanjutnya dirunning dengan alat DNA

sequencer.

Hasil sekuensing ialah berupa urutan

nukleotida adegan gen HA alamat dianalisis

dengan perangkat bioinformatik acara Mega

4.0 yang meliputi: multiple alignment, deductive

amino acid prediction, pair wise distance

calculation dengan tanaman kekerabatan (Tamura et

al., 2007).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil amplifikasi adegan TPR dengan

desain primer yang disusun oleh Lee et al., (2001)

sesuai alamat amplifikasi ialah dengan produk

akhir 545 bp. Pita DNA yang teramati cukup

baik, tanpa teramati pita DNA yang bersifat non

spesifik. Primer tersebut juga dipakai oleh

peneliti Indonesia lainnya, seperti: Dharmayanti

et al., (2006); Dharmayanti dengan Darminto,

(2009), dengan produk layak baik. Contoh hasil

amplifikasi di investigasi ini disajikan pada

Gambar 1.

Gambar 1. Contoh produk amplifikasi 545 bp adegan gen H5 yang diperoleh TPR dengan denai antigenik.

Lane A, B, C, D, dengan E merupakan isolat mikrob flu burung, lane (-) merupakan kontrol

negatif dengan lane L merupakan DNA ladder 100 bp

Wibowo et al Jurnal Veteriner

106

Hasil perbandingan masam amino penting

domain TPR tersebut dapat diamati atas Tabel

1. Menurut Zhou et al., (2007) kaum domain

penting yang bertanggung balasan atas tapak

perlekatan reseptor dengan bersifat abadi pada

virus flu burung subtipe H5N1, terletak pada

posisi Y 91, W 149, I 151, H 179, N 182, E 186,

190 L dengan 192 Q. Konsensus sekuens untuk sisi

kiri TPR merupakan kedudukan masam amino ke 130-134,

yaitu GVSSA dengan untuk bidang kiri kedudukan 220-

224 merupakan NGQSG (Kovacova et al., 2002; Zhou

et al., 2007). Kovacova et al., (2002) melaporkan

bahwa di antara masam amino tersebut, tujuh di

antaranya berhubung melantas dengan sel

reseptor inang, ialah Y 91, W 150, T 152, H

180, E 187, L 191, dengan Y 192 (H1 numbering

system). Posisi tersebut bertemu dengan H5 num-

bering system atas masam amino Y 91, W 149, I

151, H 179, E 186, L 190, dengan Y 191. Posisi asam

amino 152 T (H1 numbering system) tersebut

merupakan masam amino yang atas umumnya

ditemukan atas VAI subtipe H1, H2 dengan H3.

Posisi tersebut bagi Kovacova et al., (2002)

adalah concerved residue yang bersifat rendah,

dan memungkinkan penukaran masam amino

yang bersifat hidrofobik, misalnya: valin, leusin

dan isoleusin.

Tabel 2. Analisis masam amino TPR gen HA mikrob AI subtipe H5N1 yang diisolasi sejak tahun 2003

sampai 2008

Nama isolat Tapak Perlekatan Reseptor (H5 numbering system) Glikosilasi

91 129 130 131 132 133 134 149 151 182 186 190 191 192 154 155 156

#AF144305.1A/Goose/Guandong/1/1996 Y S G V S S A W I N E L Y Q - - -

#AF364334.1|A/Goose/Guandong/6/1997 Y S G V S S A W I N E L Y Q - - -

#AY741213.1|A/Blackbird/Hunan/2004 Y L G V S S A W I N E L Y Q - - -

#DQ320912.1|A/Duck/Hunan/2005 Y S G V S S A W I N E L Y Q - - -

#GQ122385.1|A/Chicken/East-Java/2003 Y S G V S S A W I N E L Y Q - - -

#GQ122384.1|A/Chicken/West-Java/2003 Y S G V S S A W I N E L Y Q - - -

#GQ122389.1|A/Quail/Jogja/2004 Y S G V S S A W I N E L Y Q - - -

#DQ497657.1|A/Chicken/Jembrana/2004 Y S G V S S A W I N E L Y Q N S T

#EU124276.1|A/Chicken/West_Java/2006 Y L G V S S A W I N E L Y Q N S T

#GQ122555.1|A/Chick/East_Java/2006 Y S G V S S A W I N E L Y Q N S T

#EU124152.1|A/Chicken/JKT/2006 Y S G V S S A W I N E L Y Q - - -

#EU124208.1|A/Chicken/GK/2006 Y S G V S S A W I N E L Y Q N S T

#GQ122402.1|A/Chicken/Jatim/2007 Y S G V S S A W I N E L Y Q N N T

#EU124212.1|A/Chicken/MGL/2007 Y S G V S S A W I N E L Y Q N S T

#EU124214.1|A/Chicken/SMG/2007 Y S G V S S A W I N E L Y Q N S T

#CY014177.1|A/Human/CDC/Indo/2005 Y S G V S S A W I N E L Y Q N S T

#CY014199.1|A/Human/CDC/Indo/2005 Y S G V S S A W I N E L Y Q N S T

#CY014210.1|A/Human/CDC/Indo/2006 Y S G V S S A W I N E L Y Q N S T

#CY014272.1|A/Human/CDC/Indo/2006 Y L G V S S A W I N E L Y Q N N T

#CY019360.1|A/Human/CDC/Indo/2007 Y S G V S S A W I N E L Y Q N S T

#CY019400.1|A/CDC/Human/Indo/2007 Y S G V S S A W I N E L Y Q N S T

#A/NC/Jogja/MHW-RBS-01/2008 Y S G V S S A W I N E L Y Q N S T

#A/Layer/Jabar/MHW-RBS-02/2008 Y - G V S S A W T N E L Y Q N S T

#A/Broiler/SMG/MHW-RBS-05/2008 Y S G V S S A W I N E L Y Q N S T

#A/NC/Jogja/MHW-RBS-06/2008 Y S G V S S A W I N E L Y Q N S T

#A/Quail/Solo/MHW-RBS-11/2007 Y S G V S S A W I N E L Y Q - - -

#A/MD/MTL/Pokja-RBS-15/2007 Y S G V S S A W I N E L Y Q N S T

#A/Layer/Solo/MHW-RBS-23/2007 Y S G V S S A W I N E L Y Q N S T

#A/Layer/Solo/MHW-RBS-25/2007 Y S G V S S A W I N E L Y Q N S T

#A/Quail/Solo/MHW-RBS-26/2007 Y S G V S S A W I N E L Y Q - - -

#A/MD/MTL/Pokja-RBS-16/2007 Y S G V S S A W I N E L Y Q N S T

#A/Quail/Jogja/MHW-RBS-30/2007 Y S G V S S A W I N E L Y Q - - -

#A/Layer/Jatim/MHW-RBS-AL1/2007 Y S G V S S A W I N E L Y Q N S T

#A/MD/Jogja-PST/RBS-UA1/2006 Y S G V S S A W I N E L Y Q N S T

#A/MD/MGL/UGM-RBS-UA2/2006 Y S G V S S A W I N E L Y Q N S T

#A/Duck/Jogja-PST/UGM/RBS-UA3/2006 Y S G V S S A W I N E L Y Q N S T

#A/Duck/Jatim/UGM/RBS-UA4/2005 Y S G V S S A W I N E L Y Q N S T

#A/Layer/MGL/MHW-RBS-AL2/2005 Y S G V S S A W I N E L Y Q N S T

#A/Layer/Jogja-KP/MHW-RBS-AL3/2004 Y S G V S S A W I N E L Y Q N S T

#A/Layer/Jogja/MHW-RBS-/2004 Y S G V S S A W I N E L Y Q N S T

#A/Duck/Jatim/MHW-RBS-8/2003 Y S G V S S A W I N E L Y Q N S T

#A/Layer/Purwokerto/MHW-RBS-12/2003 Y S G V S S A W I N E L Y Q N S T

Catatan:

a. Menurut Kovacova et al. (2002) Aa posisi: 91, 149, 151, 179, 186, 190 dengan 191.

b. Menurut Muramoto et al. (2006) Aa posisi: idemtito + 132 dengan 182.

c. Menurut Smith et al.(2006) Aa posisi: idemtito + 129

d. Menurut Zhou et al. (2007) Aa posisi: 91, 149, 151, 179, , 182, 186, 190 dengan 192.

e. Receptor binding cavity bidang kanan: 130, 131, 132, 133 dengan 134, dengan Tapak Glikosilasi: 154, 155 dengan 156 menurut, Kovacova et al.

(2002) dengan Zhou et al. (2007).

f. Tercetak bold merupakan isolat yang diteliti.

Jurnal Veteriner Juni 2012 Vol. 13 No. 2: 102-112

107

Hasil senada disampaikan oleh Muramoto

et al., (2006) yang melancarkan pengurangan mikrob AI

subtipe H5N1 isolat Vietnam atas tahun 2004

sampai 2005, membuktikan bahwa masam amino

penting atas TPR bertemu dengan laporan

penelitian Kovacova et al., (2002) dengan Zhou et

al., (2007), biarpun Muramoto et al., (2006)

menyatakan kecuali tujuh masam amino tersebut,

residu kedudukan 136 serin dengan 186 asparagin (H3

numbering system) bertemu dengan S 132 dan

N 182 (H5 numbering system) yang berperan

penting atas TPR. Menurut Smith et al., (2006)

residu bena di TPR yang belum

dilaporkan oleh peneliti lebih dahulu adalah

posisi 129 (H5 numbering system) yang pada

umumnya ditempati oleh serin.

Asam amino kedudukan 91 merupakan Y dan

menurut produk pengurangan terbukti kedudukan tersebut

bersifat abadi yang teramati atas virus

ancestral dengan mikrob flu burung yang diteliti sejak

tahun 2003 cukup 2008. Menurut Kovacova et

al., (2002) masam amino 91 Y merupakan asam

amino yang bersifat lestari, bahkan di antara

15 subtipe mikrob flu burung yang ada. Al-Majhdi

(2007) melaporkan bahwa kedudukan masam amino Y

91, bersama sama dengan masam amino kedudukan H

179, W 149, dengan I 151 menempati kedudukan pada

permukaan sialic acid binding site. Studi

dengan kristalografi membuktikan bahwa asam

amino tersebut berhubung dengan masam sialat

melalui belembang hidrogen.

Asam amino kedudukan 129 atas sarwa virus

flu burung di investigasi ini merupakan serin (S),

kecuali mikrob A/Layer/Jabar/MHW-RBS-02/2008

yang membuktikan delesi masam amino posisi

129. Secara am produk tersebut bertemu dengan

laporan Wu et al., (2008), ialah menurut umum

virus akar Indonesia yang teperlus Group A,

B, dengan C merupakan serin. Kondisi tersebut berbeda

untuk mikrob yang diperoleh dari gene bank, yaitu

A/Duck/Hunan/2005 dengan duet mikrob Indonesia,

yaitu A/Chicken/Jembrana/2004 dengan A/Human/

CDC/Indo/2006; kedudukan tersebut diisi oleh leusin.

Menurut Smith et al., (2006) kaum virus

yang diisolasi atas tahun 2004 cukup 2005,

menunjukkan mutasi S 129 L yang teramati

pada mikrob akar Vietnam dengan Indonesia. Virus

flu burung yang cecap mutasi S 129 L di

Indonesia dilaporkan teramati atas mikrob flu

burung dari Group C, ialah mikrob yang diisolasi

di Sumatera Utara atas tahun 2005. Substitusi

L 129 V dengan A 134 V, juga terdapat atas virus

flu burung isolat Thailand Th 676 DQ 360835

(Auewarakul et al., 2007). Substitusi tersebut

cukup menarik atas kedudukan keduanya berada

dalam loops 130 receptor binding cavity. Studi

pola hemaglutinasi yang dilakukan dengan virus

mutan L 129 V dengan A 134 V menunjukkan

peningkatan alternatif AS α 2,6 Gal., namun

jika mutasi tersebut hanya dilakukan atas L

129 V, mikrob mutan tersebut tak menunjukkan

perubahan alternatif reseptor.

Asam amino kedudukan 130, 131, 132, 133, dan

134 atas sarwa mikrob flu burung yang diamati

dalam investigasi ini bersifat lestari, yaitu

GVSSA. Menurut Kovacova et al., (2002) posisi

tersebut melenggekkan bidang kiri receptor binding

cavity dengan atas umumnya bersifat lestari,

meskipun untuk mikrob flu burung dengan subtipe

yang berlainan mempunyai susunan masam amino

yang berlainan pula. Sebagai contoh merupakan virus

influenza subtipe H1 kedudukan 130 cukup 134

tersebut relevan dengan kedudukan 131 cukup 135

(H1 numbering system) mempunyai konsesus

sekuen GVTAA. Posisi tersebut juga relevan

dengan masam amino nomer 134 cukup 138 (H3

numbering system) dengan sekuen GGSNA.

Mutasi masam amino kedudukan A 134 V bersama

dengan masam amino kedudukan L 129 V mempunyai

peran di menentukan alternatif reseptor

inang (Auewarakul et al., 2007).

Asam amino kedudukan 149 W atas mikrob flu

burung di investigasi ini teramati lestari.

Hasil tersebut bertemu dengan berita penelitian

terdahulu yang disampaikan oleh Kovacova et

al., (2002); Muramoto et al., (2006); Zhou et al.,

(2007), bahwa sejauh ini masam amino posisi

tersebut acap bersifat lestari. Menurut Al-

Majhdi (2007) triptofan (W) kedudukan 153 (H3

numbering system) bertemu dengan W 149 (H5

numbering system) bersifat non-polar yang akan

berinteraksi dengan masam sialat atas daerah

yang bersifat hidrofobik dengan belembang van der

Waals.

Asam amino kedudukan 151 merupakan isoleusin (I).

Diantara mikrob flu burung yang diteliti terdapat

satu isolat, ialah A/Layer/Jabar/MHW-RBS-02/

2008 yang cecap mutasi nukleotida

penyusun isoleusin kedudukan 151, ialah CTT menjadi

CCT sehingga menyebabklan mutasi asam

amino isoleusin 151 jadi threonine (T). Data

pesejajaran di antara subtipe mikrob influenza

yang dilakukan oleh Kovacova et al., (2002)

menunjukkan bahwa masam amino T 151 pada

umumnya dimiliki oleh mikrob influenza A

subtipe H1, H2, alias H3. Posisi tersebut bersifat

kurang stabil dibdaningkan ampas masam amino

lain atas lingkungan TPR dengan dapat bervariasi di

antara subtipe mikrob flu burung yang ada.

Menurut Zhou et al., (2007) masam amino

posisi 154, 155, dengan 156 merupakan tempat

potensial terjadinya glikosilasi. Secara umum

potensi glikosilasi atas isolat mikrob flu burung

yang diisolasi dari beragam spesies ayam pada

Wibowo et al Jurnal Veteriner

108

sejak tahun 2003 cukup 2008 dengan variasi

gejala klinis dengan patologis serta yang diisolasi

dari ayam dengan atau tanpa vaksinasi

mempunyai corak NST atas kedudukan 154, 155, dan

156. Menurut Shakin-Eshlemen et al., (1996) N-

linked glikosilasi atas umumnya berlaku pada

sekuens dengan corak N-X-S alias N-X-T. Posisi

X merupakan masam amino kecuali prolin. Kasturi

et al., (1995) melaporkan bahwa atas umumnya

sekuens N-X-T merupakan corak yang lebih

efisien untuk cecap penambahan rantai

samping karbohidrat (glikosilasi) dibandingkan

sekuens N-X-S. Glikosilasi atas lingkungan TPR

juga berlaku atas mikrob pilek subtipe H3,

terutama yang diisolasi selama dengan setelah

tahun 1975 (Schulze, 1997). Glikosilasi terjadi

pada masam amino kedudukan 126, yang merupakan

residu yang berdekatan dengan TPR dan

dilaporkan sebagai denai yang bertanggung

jawab atas fiil antigenik mikrob tersebut.

Iwatsuki-Horimoto et al., (2004) melakukan

analisis sekuens HA mikrob A/Ty/Ont/66 (H5N9),

dan mendapatkan duet titik potensial glikosilasi

pada kedudukan 131 dengan 158 (H3 numbering system),

namun atas mikrob flu burung HK/97 tidak

terdapat glikosilasi. Analisis bertambah berumur menun-

jukkan bahwa perbedaan glikosilasi pada

domain TPR tersebut tak dapat menjelaskan

perbedaan introduksi reseptor, biarpun kebe-

radaan karbohidrat atas kedudukan dekat domain

TPR, dapat meningkatkan afinitas dengan spesifitas

ikatan dengan reseptor. Menurut WHO (2005)

perubahan struktural HA dapat berlaku karena

mutasi alanin kedudukan 156 jadi treonin, sehing-

ga berlaku glikosilasi. Proses tersebut diprediksi

menurunkan afinitas terhadap reseptor.

Asam amino kedudukan 182 merupakan asparagin

(N). Sejauh ini kedudukan tersebut bersifat sangat

lestari baik atas masam amino maupun

nukleotida penyusunnya. Hasil yang sama

dilaporkan oleh Kovacova et al., (2002);

Muramoto et al., (2006); Zhou et al., (2007).

Asam amino atas kedudukan N 182 tersebut

menunjukkan ampas yang bersifat abadi di

antara subtipe HA yang beda (Kovacova et al.,

2002). Menurut Yamada et al., (2006) asam

amino kedudukan N 182 dengan glutamin (Q) 192

merupakan masam amino yang berperan untuk

menjaga kemantapan hubungan dengan reseptor

asam sialat. Mutasi ampas N 182 jadi L

atau Q 192 jadi R dianggap mampu

menyebabkan metamorfosis spesifitas reseptor SA

α 2,3 Gal., ke alternatif reseptor masam sialat α

2, 6 Gal. Secara alami mikrob yang mengalami

mutasi atas kedudukan tersebut dilaporkan terjadi

pada mikrob flu burung clade-2 yang diisolasi dari

orang di Azerbaijan dengan Irak.

Struktur α-heliks yang terdiri arah asam

amino kedudukan 186 glutamat (E), 190 leusin (L),

dan 191 tirosin (Y) bersifat concerved (Kovacova

et al., 2002; Al-Majhdi 2007; Zhou et al., 2007),

bahkan di antara subtipe HA mikrob flu burung

yang sedia (Kovacova et al., 2002). Asam amino

dan nukleotida kedudukan 192 tak menunjukkan

adanya mutasi, baik isolat mikrob flu burung awal

wabah cukup isolat tahun 2008. Menurut

Yamada et al., (2006) masam amino kedudukan N 182,

dan Q 192 berperan untuk melindungi stabilitas

ikatan dengan reseptor masam sialat inang.

Asam amino kedudukan loops 220 yang terdiri

dari kedudukan 220, 221,223, dengan 224 merupakan

receptor binding cavity bidang sebelah kiri (Kovacova

et al., 2002). Beberapa peneliti melaporkan

bahwa atas kedudukan tersebut, untuk mikrob flu

burung subtipe H5N1 mempunyai motif

NGQSG (Kovacova et al., 2002; Zhou et al.,

2007). Posisi tersebut berlainan untuk virus

influenza subtipe H1, ialah mempunyai motif

RGQAGR, sedangkan mikrob subtipe H3,

mempunyai corak RGQSGR (Kovacova et al.,

2002). Menurut Naeve et al., (1984) atas RBC

tersebut diperoleh ampas masam amino penting

yang berperan di alternatif pengikatan

reseptor atas mikrob influenza manusia, yaitu

asam amino kedudukan 226 dengan 228 (H2 dengan H3).

Posisi tersebut bersesuaian dengan masam amino

nomor 222 dengan 224 atas mikrob H5. Mutasi asam

amino kedudukan Gln 222 Leu dengan Gly 224 Ser

berperan meningkatkan kecondongan pengi-

katan reseptor corak ayam mengarah ke resep-

tor corak manusia, namun demikian mutasi

tersebut belum pernah dilaporkan atas virus

flu burung subtipe H5N1 (Gutierrez et al., 2009).

Menurut Yamada et al., (2006) mutasi asam

amino Asn 182 Lys dengan GLn 192 Arg atas virus

flu burung subtipe H5N1 menurut independen

mampu melantarkan metamorfosis pengikatan

preferensi reseptor corak ayam SA α 2,3 Gal.,

ke corak bani Adam SA α 2,6 Gal. Auewarakul et

al., (2007) melaporkan mikrob flu burung subtipe

H5N1 yang mempunyai preferansi reseptor SA

α 2,3 Gal., cecap metamorfosis preferensi

reseptor yang mengarah ke reseptor α 2,3 Gal.,

dan SA α 2,6 Gal., atas berlaku substitusi

asam amino Leu 129 Val dengan Ala 134 Val. Mutasi

tersebut dapat melantarkan kemantapan ikatan

SA α 2,6 Gal., atas RBC di hal yang

optimal atas terikat di konformasi cis.

Analisis tanaman kekerabatan yang dibentuk

berdasarkan adegan gen HA atas nukleotida

posisi 208 cukup 612, membentuk beberapa

kelompok mikrob flu burung (Gambar 2). Virus

flu burung yang diisolasi atas tahun 2003, 2004,

2005, dengan per satu mikrob flu burung

Jurnal Veteriner Juni 2012 Vol. 13 No. 2: 102-112

109

yang diisolasi atas tahun 2006 dengan 2007 yang

diteliti membentuk klaster mikrob tersendiri. Ke

dalam kelompok tersebut berdekatan dengan

klaster mikrob flu burung yang diisolasi atas awal

wabah yang telah diperoleh atas gene bank yang

menunjukkan afinitas genetik dengan virus

A/Duck/Hunan/2005, A/Blackbird/Hunan/2004,

dan mikrob induk. Analisis tersebut bersesuaian

dengan berita Wang et al., (2008) yang

melaporkan bahwa mikrob flu burung yang

diisolasi di Indonesia mempunyai kedekatan

genetik dengan mikrob akar Hunan, Cina Selatan.

Virus flu burung yang diisolasi atas tahun

2006, 2007, dengan 2008 membantuk klaster

tersendiri dengan percabangan yang bertambah jauh.

Dari klaster tersebut terbentuk sub-klaster yang

terdiri arah isolat mikrob A/Layer/Jabar/MHW-

RBS-02/2008, A/Chicken/West Java/2006, virus

flu burung akar bani Adam tahun 2007, dengan virus

A/MD/MTL/Pokja-RBS-15/2007. Salah satu

isolat, ialah A/Layer/Jabar/MHW-RBS-02/2008,

menunjukkan percabangan yang paling jauh.

Kondisi tersebut diperkirakan karena

banyaknya mutasi yang berlaku atas fragmen

RBS atas mikrob flu burung tersebut.

Gambar 2. Pohon kekerabatan adegan gen HA VAI subtipe H5N1 yang diperoleh TPR di sepanjang

nukleotida 208 – 612. Notasi dengan huruf tebal merupakan isolat yang diteliti.

Wibowo et al Jurnal Veteriner

110

Gambaran tanaman kekerabatan adegan gen

HA yang diperoleh TPR di investigasi ini

tidak membuktikan cermin distribusi tertentu dari

spesies ayam atau ceceran geografis, tetapi

secara am klaster mikrob flu burung tersebut

cenderung berdasar atas tahun pengasingan mikrob flu

burung yang diteliti. Pola ceceran mikrob tersebut

bersesuaian dengan produk pengurangan Wang et al.,

(2008) bahwa cermin percabangan pohon

kekerabatan yang digambarkan tak teramati

adanya mikrob yang berkelompok berdasarkan

spesies dengan ceceran geografis tertentu. Kondisi

tersebut berlainan dengan berita Lam et al.,

(2008) bahwa pengurangan filogenetik gen HA virus

flu burung akar Indonesia membuktikan adanya

kelompok spesies, pertama mikrob flu burung

yang diisolasi dari manusia. Virus flu burung

asal ayam membentuk klaster tersendiri

meskipun tak sedia cermin ceceran di antara

spesies ayam yang diteliti.

SIMPULAN

Berdasarkan data persejajaran dalam

penelitian ini kedapatan bahwa mikrob flu burung

subtipe H5N1 yang diisolasi dari berbagai

unggas sejak tahun 2003 cukup 2008, teramati

beberapa masam amino bena TPR yang bersifat

lestari dengan membuktikan kecenderungan

berikatan dengan reseptor corak ayam SA α 2,3

Galaktosa. Salah satu isolat yang diteliti yaitu

A/Layer/Jabar/MHW-RBS-02/2008 (H5N1)

menunjukkan delesi masam amino kedudukan 129 dan

mutasi masam amino I 151 T, yang pada

umumnya terdapat atas mikrob influenza A

subtipe lain, ialah H1, H2 alias H3. Analisis

pohon kekerabatan tak teramati klaster virus

flu burung yang membuktikan cermin distribusi

tertentu dari spesies ayam atau sebaran

geografis akar mikrob yang diteliti.

SARAN

Untuk memafhumi ampas masam amino pada

receptor binding cavity bidang kiri perlu dilakukan

amplifikasi gen HA mikrob flu burung yang

terdapat TPR atas kedudukan loops 220.

UCAPAN TERIMA KASIH

Terima afeksi disampaikan kepada Prof Dr

drh I Gusti Ngurah Kade Mahardika, Lab

Biomedik dengan Molekuler, drh I Wayan

Suardana, MSi. Lab. Kesmavet, FKH.

Universitas Udayana. Ir Jaka Widada, Mp.Ph.D

Lab Bioteknologi PAU UGM arah sharing

bioinformatik serta drh Khisdiana Putri, MP.

Lab Mikrobiologi, FKH UGM, arah bantuan

teknis makmal yang telah diberikan.

DAFTAR PUSTAKA

Al-Majhdi FN. 2007. Structure of the Sialic Acid

Binding Site in Influenza A Virus:

Hemagglutinin. J Biol Sci 7 (1): 113-122.

Auewarakul P, Suptawiwat O, Kongchanagul

A, Sangma C, Suzuki Y, Ungchasak K,

Louisirirotchanakul S, Lerdsamran H,

Pooruk P, Thitithanyanont A,

Pittayawonganon C, Guo CT, Hiramatsu H,

Jampangern W, Chunsutthiwat S, dan

Puthavathana P, 2007. An Avian Influenza

H5N1 Virus that Bind to a Human-Type

Receptor. J Virol 81 (18): 9950-9955.

Cox N J, dengan Kawaoka Y. 1998.

Orthomyxoviruses: Influenza. Di dalam:

Microbiology ang Microbial Infection, (eds)

Collier, L., Balows, A., dengan Sussman, M.,

Vol. 1: Virology, New York. Oxford

University Press, Inc. Pp.: 386-433.

Dharmayanti NILP, Indriani, dengan Adjid RMA.

2006. Identifikasi Virus Avian Influenza

pada Beberapa Jenis Unggas di Taman

Margasatwa Ragunan dengan Upaya

Eradikasinya. Media Kedokteran Hewan 22

(2): 79-83.

Dharmayanti NILP, Darminto. 2009. Mutasi

Virus AI di Indonesia: Antigenic drift

Protein Hemaglutinin (HA) Virus Influenza

H5N1 Tahun 2003-2006. Media Kedokteran

Hewan 25 (1): 68-73.

Gambaryan A, Tuzikov A, Pazynina G, Bovin

N, Balish A, dengan Klimov A. 2006. Evolution

of the Receptor Binding Phenotype of

Influenza A (H5) Viruses. Virol 344: 432-

438.

Gutierrez RA, Naughtin MJ, Horm SV, San S,

Buchi P. 2009. A (H5N1) Virus Evolution

in South East Asia. Viruses 1, doi: 10.3390/

v1030335: 335-361

Jurnal Veteriner Juni 2012 Vol. 13 No. 2: 102-112

111

Horimoto T, Kawaoka Y. 1997. Biologic Effect of

Introducing Additional Basic Amino Acid

Residue into the Hemagglutinin Cleavage

Site of a Virulent Avian Influenza Virus.

Virus Research 50: 35-40.

Horimoto T, dengan Kawaoka Y. 2001. Pdanemic

Threat Posed by Avian Influenza A Viruses.

Clin Microbiol Rev 14: 129-149.

Horimoto T, dengan Kawaoka Y. 2005. Influenza:

Lessons from Past Pdanemics Warnings

from Current Incidens. Nat Rev Microbiol

2005, 3:591-600.

Iwatsuki-Horimoto K, Kanazawa R, Sugii S,

Kawaoka Y, dengan Horimoto T. 2004. The

Index Influenza A Virus Subtype H5N1

Isolated from a Human in 1997 Differ in Its

Receptor Binding Properties from a Virulent

Avian Influenza Virus. J Ge. Virol 85: 1001-

1005.

Kasturi L, Eshleman JR, Wunner WH, dan

Shakin-Eshlemen SH. 1995. The Hydroxy

Amino Acid in an Asn-X-Ser/Thr Sequon

Can Influence N-Linked Core Glycosylation

Efficiency dengan The Level of Expression of a

Cell Surface Glycoprotein. J of Biol Chem

270 (24): 14756-14761.

Kheawcharoen, Oraveerakul K, Kuiken T,

Fourchier RA, Amonsin A, Payungporn S.

2004. An Avian Influenza H5N1 in Tiger

dan Leopard. Emerg Infect Dis 10: 2189-

2191.

Komnas FBPI. 2007. Data Perkembangan

Penyakit Avian Influenza di Indonesia, 1

Januari 2007 cukup dengan November

2007. Komisi Nasional Pengendalian Flu

Burung dengan Kesiapsiagaan Menghadapi

Pdanemi Influenza (Komnas FBPI). http://

www.komnasfbpi.go.id.

Kovacova A, Ruttkay-Nedecky G, Haverlik IK,

Janecek S. 2002. Sequence Similarities dan

Evolutionary Relationships of Influenza

Virus A Hemagglutinins. Virus Genes 24

(1): 57-63.

Lam TTY, Hon CC, Pybus OG, Kosakovsky

Pond SL, Wong RTY, Yip CW, Zeng F,

Leung FCC. 2008. Evolutionary dan

Transmission Dynamics of Reassortant

H5N1 Influenza Virus in Indonesia. PLoS

Pathog 4(8): e 1000130. Doi:10.1371/

journal.ppat.1000130.

Lee M, Chang P, Shien J, Cheng M, dengan Shieh

HK. 2001. Identification dengan Subtyping of

Avian Influenza Viruses by Reverse

Transcription-PCR. J Virol Method 97:13-

22.

Muramoto Y, Le TQM, Phuong LS, Nguyen T,

Nguyen TH, Sakai-Tagawa Y, Iwatsuki-

Horimoto K, Horimoto T, Kida H, Kawaoka

Y. 2006. Molecular Characterization of the

Hemagglutinin dengan Neuraminidase Genes

of H5N1 Influenza A Viruses Isolated from

Poultry in Vietnam from 2004 to 2005. J

Vet Med Sci 6 (5): 527-531.

Naeve CW, Hinshaw SV, Webster R G. 1984.

Mutations in the Hemagglutinin Receptor

Binding site Can Change the Biological

Properties of Influenza Virus. J Virol 51.:

567-569.

Schulze IT. 1997. Effect of Glycosylation on the

Properties dengan Fuctions of Influenza Virus

Hemagglutinin. J of Infect Dis 176 (Suppl

1): S24-28.

Shakin- Eshlemen SH, Spitalnik SL, dan

Kasturi L. 1996. The Amino Acid at the X

Position of an Asn-X-Ser Sequon is an

Important Determinant of N-Linked Core-

Glycosilation Efficiency. J of Biol Chem 271

(11): 6363-6366.

Smith GJD, Naipospos TSP, Nguyen TD, de

Jong MD, Vijaykrishnan D, Usman TB,

Hassan S S, Nguyen TV, Dao TV, Bui NA,

Leung YHC, Cheung CL, Rayner JM, Zhang

JX, Poon LLM, Li KS, Nguyen VC, Hien

TT, Farrar J, Webster RG, Chen H, Peiris

JSM, Guan Y. 2006. Evolution dan

Adaptation of H5N1 Influenza Virus in Avian

dan Human Hosts in Indonesia dan

Vietnam. Virol 350: 258-268.

Songserm T, Alongkorn A, Rungroj J, Namdee

SH, Noppodal M, Nuananong P, Sunchai

P, Apiradee T, Yong P. 2006-a. Avian

Influenza H5N1 in Naturally Infected

Domestic Cat. Emerg Infect Dis 12 (4): 681-

683.

Songserm T, Alongkorn A, Rungroj J, Namdee

SH, Nuananong P, Sunchai P, Apiradee T,

Salin S, Roongrejo T, Yong P. 2006-b. Fatal

Avian Influenza A H5N1 in a Dog. Emerg

Infect Dis 12 (1100: 1744-1747.

Steven J, Blixt O, Tumpey TC, Taubenberger

JK, Paulson JC, Wilson I. 2006. Structure

dan Receptor Specifity of the Hemagglutinin

from an H5N1 Influenza Virus. Research

Article. 312 : 404-410. www.sciencemag.org.

Subarrao K, Klimov A, Katz J, Regnery H, Lim

W, Hall H, Perdue M, Swayne D, Bender

C, Huang J, Hemphill M, Rowe T, Shaw M,

Xu X, Fukuda K, Cox N. 1998.

Characterization of an Avian pilek A

(H5N1) mikrob Isolated from a Child with

Fatal Respiratory Illness. Science 279: 393-

396.

Wibowo et al Jurnal Veteriner

112

Suzuki Y, Ito I, Suzuki T, Holtdan KEJr,

Chambert TM, Kiso M, Ichida H, Kawaoka

Y. 2000. Sialic Acid Species as a Determinant

of the Host Range of Influenza AViruses. J

Virol 74 (24) : 11825-11831.

Takano R, Nidom CA, Kiso M, Muramoto Y,

Yamada S, Shinya K, Sakai-Tagawa Y,

Kawaoka Y. 2009. A Comparation of the

Pathogenicity of Avian dengan Swine H5N1

Influenza Viruses in Indonesia. Arch Virol

154: 677-681.

Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. 2007.

MEGA 4: Molecular Evolutionary Genetics

Analysis (MEGA) Software Version 4.0.

Molecular Biology dengan Evolution 10. 1093/

molbev/msm092.

Wang J, Vijaykrishna D, Duan L, Bahl J, Zhang

JX, Webster RG, Peiris JSM, Chen H,

Smith GJD, Guan Y, 2008. Identification of

the Progenitors of Indonesian dan

Vietnamese Avian Influenza A (H5N1)

Viruses from Southern China. J Virol 28

(7): 3405-3414.

WHO. 2002. WHO Manual on Animal Influenza

Diagnosis dengan Surveillance. Department of

Communicable Disease Surveillance dan

Respon. WHO/CDS/CSR/NCS/2002.5 Rev.1.

WHO. 2005. Global Influenza Surveilance

Network, 2005: Evolution of H5N1 Avian

Influenza Viruses in Asia. Emerg Infec Dis

11 (10): 1515-1521.

Wu WL, Chen Y, Wang P, Song W, Lau SY,

Rayner JM, Smith GJD, Webster RG, Peiris

JSM, Lin T, Xia N, Guan Y, Chen H. 2008.

Antigenic Profile of Avian H5N1 Viruses in

Asia from 2002 to 2007. J Virol 82 (4): 1798-

1807.

Yamada S, Suzuki Y, Suzuki T, Le MQ, Nidom

CA, Sakai-Tagawa Y, Muramoto Y, Ito M,

Kiso M, Harimoto T, Shinya K, Sawada T,

Kiso M, Usui T, Murata T, Lin Y, Hay A,

Haire LF, Stevevs DJ, Russell RJ, Gamblin

SJ, Skehel JJ, Kawaoka Y. 2006.

Haemagglutinin Mutations Responsible for

the Binding of H5N1 Influenza A Viruses to

Human Type Receptors. Nature 444 (16):

378 - 382.

Zhou JJ, Fu J, Fang DY, Yan HJ, Tian J, Zhou

JM, Pao JP, Liang Y, Jiang LP. 2007.

Molecular Characterization of the Surface

Glycoprotein Genes of an H5N1 Influenza

Virus Isolated from Human in Gudanong,

China. Arch Virol 152: 1515 – 1521.

Jurnal Veteriner Juni 2012 Vol. 13 No. 2: 102-112

This research hasn't been cited in any other publications.

  • An outbreak of highly pathogenic avian pilek A (H5N1) has recently spread to poultry in 9 Asian countries. H5N1 infections have caused >52 human deaths in Vietnam, Thailand, and Cambodia from January 2004 to April 2005. Genomic analyses of H5N1 isolates from birds and humans showed 2 distinct clades with a nonoverlapping geographic distribution. All the viral genes were of avian influenza origin, which indicates absence of reassortment with human pilek viruses. All human H5N1 isolates tested belonged to a single clade and were resistant to the adamantane drugs but sensitive to neuraminidase inhibitors. Most H5N1 isolates from humans were antigenically homogeneous and distinct from avian viruses circulating before the end of 2003. Some 2005 isolates showed evidence of antigenic drift. An updated nonpathogenic H5N1 reference virus, lacking the polybasic cleavage site in the hemagglutinin gene, was produced by reverse genetics in anticipation of the possible need to vaccinate humans.

  • Highly Pathogenic Avian Influenza (HPAI) H5N1 mikrob is an ongoing public health and socio-economic challenge, particularly in South East Asia. H5N1 is now endemic in poultry in many countries, and represents a major pandemic threat. Here, we describe the evolution of H5N1 mikrob in South East Asia, the reassortment events leading to high genetic diversity in the region, and factors responsible for mikrob spread. The mikrob has evolved with genetic variations affecting virulence, drug-resistance, and adaptation to new host species. The constant surveillance of these changes is of primary importance in the global efforts of the scientific community.

  • Highly pathogenic avian pilek H5N1 viruses are circulating in many countries. We recently discovered that these viruses have been transmitted to pigs on multiple occasions in Indonesia. To investigate whether avian H5N1 pilek viruses adapted to mammals through their introduction into pigs, we examined the growth of avian and swine isolates in cell culture and compared their pathogenicity in mice. We found that swine isolates were less virulent to mice than avian isolates, suggesting that the viruses became attenuated during their replication in pigs. Continuous surveillance of H5N1 viruses among pigs is clearly warranted.

  • H5N1 highly pathogenic avian pilek (HPAI) viruses have seriously affected the Asian poultry industry since their recurrence in 2003. The viruses pose a threat of emergence of a global pandemic pilek through point mutation or reassortment leading to a strain that can effectively transmit among humans. In this study, we present phylogenetic evidences for the interlineage reassortment among H5N1 HPAI viruses isolated from humans, cats, and birds in Indonesia, and identify the potential genetic parents of the reassorted genome segments. Parsimony analyses of viral phylogeography suggest that the reassortant viruses may have originated from greater Jakarta and surroundings, and subsequently spread to other regions in the West Java province. In addition, Bayesian methods were used to elucidate the genetic diversity dynamics of the reassortant strain and one of its genetic parents, which revealed a more rapid initial growth of genetic diversity in the reassortant viruses relative to their genetic parent. These results demonstrate that interlineage exchange of genetic information may play a pivotal role in determining viral genetic diversity in a focal population. Moreover, our study also revealed significantly stronger diversifying selection on the M1 and PB2 genes in the lineages preceding and subsequent to the emergence of the reassortant viruses, respectively. We discuss how the corresponding mutations might drive the adaptation and onward transmission of the newly formed reassortant viruses.

  • Avian pilek mikrob reassortants containing human pilek mikrob hemagglutinins do not replicate in ducks. Two mutations in the receptor-binding site of a human hemagglutinin at residues 226 and 228 allowed replication in ducks. The mutations resulted in a receptor-binding-site sequence identical to the known avian pilek mikrob sequences.

  • N-Linked glycosylation usually occurs at the sequon, Asn-X-Ser/Thr. In this sequon, the side chain of the hydroxy amino acid (Ser or Thr) may play a direct catalytic role in the enzymatic transfer of core oligosaccharides to the Asn residue. Using recombinant variants of rabies mikrob glycoprotein (RGP), we examined the influence of the hydroxy amino acid on core glycosylation efficiency. A variant of RGP containing a single Asn-X-Ser sequon at Asn was modified by site-directed mutagenesis to change the sequon to either Asn-X-Cys or Asn-X-Thr. The impact of these changes on core glycosylation efficiency was assessed by expressing the variants in a cell-free transcription/translation/glycosylation system and in transfected tissue culture cells. Substitution of Cys at position 39 blocks glycosylation, whereas substitution of Thr dramatically increases core glycosylation efficiency of Asn in both membrane-anchored and secreted forms of RGP. The substitution of Thr for Ser also dramatically enhances the level of expression and cell surface delivery of RGP when the sequon at Asn is the only sequon in the protein. Novel forms of membrane-anchored and secreted RGP which are fully glycosylated at all three sequons were also generated by substitution of Thr at position 39.

  • N-Linked glycosylation is a common form of zat putih telur processing that can profoundly affect zat putih telur expression, structure, and function. N-Linked glycosylation generally occurs at the sequon Asn-X-Ser/Thr, where X is any amino acid except Pro. To assess the impact of the X amino acid on core glycosylation, rabies mikrob glycoprotein variants were generated by site-directed mutagenesis with each of the 20 common amino acids substituted at the X position of an Asn-X-Ser sequon. The efficiency of core glycosylation at the sequon in each variant was quantified in a rabbit reticulocyte lysate cell-free translation system supplemented with canine pancreas microsomes. The presence of Pro at the X position completely blocked core glycosylation, whereas Trp, Asp, Chi, and Leu were associated with inefficient core glycosylation. The other variants were more efficiently glycosylated, and several were fully glycosylated. These findings demonstrate that the X amino acid is an important determinant of N-linked core-glycosylation efficiency.

  • The pilek mikrob A hemagglutinin (HA) is a trimeric glycoprotein that contains 3–9 N-linked glycosylation sequons bagi subunit, depending on the strain. The location of these sites is determined by the nucleotide sequence of the HA gene, and, since the viral genome is replicated by an errorprone RNA polymerase, mutations, which add or remove glycosylation sites, occur at a high frequency. Mutations that are not lethal to the mikrob add to the structural diversity of the mikrob population. Factors that determine the glycosylation of the HA are reviewed herein, as are the effects of host-specific glycosylation on receptor binding, fusion activity, and antigenic properties of the virus. Effects of host-specific glycosylation and selection on virulence and on vaccine efficacy and surveillance are discussed. In addition, inadequacies in our understanding of HA glycosylation and its effects on host range are emphasized.

  • We mutated the virulent avian pilek mikrob A/turkey/Ontario/7732/66 (H5N9)[Q-R-R-R-K-K-R\G at the hemagglutinin (HA) cleavage site] to create a mutant, R(MO-0), with additional basic residues at this site (Q-R-R-R-R-R-K-K-R\G) by reverse genetics. When tested in chicken embryo fibroblast culture, this mutant showed reduced HA cleavability compared to that of the wild-type virus, but its plaque size was not appreciably altered. Virulence of the R(MO-0) mikrob in chickens was lower than that of the wild-type virus. These findings indicate that addition of excessive basic residues to an optimal recognition sequence for HA cleavage enzymes at the cleavage site is deleterious for HA cleavability. Previously, we showed that a mutant containing the suboptimal HA cleavage site sequence for cleavage enzyme recognition also had reduced HA cleavability and virulence compared to the wild-type virus. We conclude that the data presented here further substantiate our belief that the kelas of HA cleavability correlates with the degree of virulence when all other genetic characteristics are considered equal, irrespective of the mechanisms by which HA cleavability is reduced.